對非活動期Graves眼病眼眶脂肪細胞fas/fasL表達的影

Fas( CD95) ，由日本 Yonehara 實驗室發現，作為位于細 胞表面重要的死亡受體，是凋亡通路中的信號分子。Fas L( CD178) ，是 fas 的天然配體，fas/fas L 交聯形成蛋白復合 體，激活下游多級酶促反應，引起細胞凋亡，研究發現自身 免疫性甲狀腺疾病的發病與凋亡信號失調相關。

1 材料與方法

1． 1 藥物和試劑

平目湯，由黃芪 30 g，淫羊藿 15 g，川芎 15 g，白芥子 15 g，炙鱉甲 15 g，車前子( 包煎) 30 g 組成，由 上海中醫藥大學附屬龍華醫院中藥房制備成水煎劑( 生藥 含量為 4 g /mL) ，4 ℃保存。 Trizol  Ｒeagent，Life Technologies Corporation 公 司; DEPC( ＲNA 酶抑制劑) ，Sigma － Aldrich － Life Science 公 司; 無水乙醇、75% 乙醇、異丙醇、氯仿、十二烷基硫酸鈉 ( SDS) ，國藥集團化學試劑有限公司; 逆轉錄試劑盒( GoScripTM Ｒeverse Transcription System) ，Promega 公司; 臺盼藍 染液、One cell 細胞計數板，上海魯汶生物科技有限公司; 引物合成，上海閃晶分子生物科技有限公司; Fas 抗體、Fas L 抗體，美國 abcam 公司; GAPDH 單克隆抗體，美國 CST 公 司; 辣根過氧化物酶標記的二抗，美國 Jackson ImmunoＲesearch 公司; 生理鹽水，上海長征富民金山制藥有限公司; Protein Marker ( PageＲulerTMPlusPrestaind Protein) ，Thermo Fisher Scientific 公司; 蛋白酶抑制劑，Ｒoche Diagnostics 公 司; 微量 BCA 蛋白定量試劑盒，康為世紀公司; 20% SDS solution、Tris － Hcl Buffer( pH 為 6． 8) 、40% 丙烯酰胺( 40% Acr) 、四甲基二乙胺( TEMED) ，BIO － ＲAD 公司; Tris － Hcl Buffer( pH8． 8) ，北京索萊寶( Solarbio) 科技有限公司; SDS － PAGE 上樣緩沖液( 5 × ) ，碧云天生物技術研究所; 甘氨 酸( MW75． 07) 、Tween 20，SIGMA － ALDＲICH 公司; 氨基 丁三醇( Tris) ( MW121． 14) ，Sigma 公司; 硝酸纖維素膜 ( PVDF 膜) ，Millipore 公司; 麗春紅染色試劑，康為世紀公 司; 脫脂奶粉( 國產伊利牌) ，內蒙古伊利實業集團有限公 司; 顯影劑試劑盒( Immobilon Western 化學發光底物) ，Millipore 公司; 胎牛血清，Biowest; DMEM 培養基，上海立菲生 物技術有限公司( life technologise) 。基因序列通過 GenBank 獲得，由上海閃晶分子生物科技有限公司設計并合 成。引物序列見表 1。

1． 2 儀器

OLYMPUS － ix71 顯微鏡，日本 OLYMPUS 公 司; 低溫冰箱、制冰機( 型號: SIM － F140) 、高壓蒸汽滅菌 器，日本 SANYO 公司; 電熱恒溫鼓風干燥箱，上海精宏實驗設備有限公司; SW － CJ 系列潔凈工作臺，蘇凈安泰公 司; 低溫離心機、Eppendorf ＲT － PCＲ 系統，Eppendorf 公司;數顯恒溫水槽( 型號: HH － 2) ，國華電器有限公司; SL202N 型電子天平，上海民橋精密科學儀器有限公司 ( 批號: 00236) ; BioTek SynergyH4 型酶標儀，Bio － Tek 公司; 純水 儀，香港 Heal Force 公司; 垂直電泳儀，BIO － ＲAD 公司; 塑 料薄膜封口機( 型號: FS － 200) ，永康市特力包裝機械有限 公司; X85 － 2S 恒溫磁力攪拌器，上海梅穎浦儀器儀表制造 有限公司; 搖床( TS － 8) ，上海精密儀器制造公司; 全自動數 碼凝膠成像系統( G: Box Chemi XT4) ，英國 Syngene 公司。

1． 3 動物和平目湯含藥血清的制備

動物: SPF 級雄性 SD 大鼠，購自上海斯萊克實驗動物有限公司，合格證號為: SCXK( 滬) 2012 － 0002。實驗動物于上海中醫藥大學實驗 動物部 SPF 級動物房進行飼養。

2 結果

與空 白對照組比較，平目湯中劑量組對脂肪細胞 fas mＲNA 的相 對表達量升高( P ＜ 0. 05) ，其余各組則無統計學差異( P ＞ 0. 05) 。與空白對照組比較，平目湯組對脂肪細胞 fas LmＲNA 的相對表達量均升高( P ＜ 0. 05) ，地塞米松組則無 統計學差異( P ＞ 0. 05) 。平目各湯組間比較: 平目湯高劑 量組與平目湯低劑量組比較，差異有統計學意義 ( P ＜ 0. 05) 。見表 2、圖 1。

與空白 對照組相比，平目湯各組 fas、fas L 蛋白表達均上調，差異有 統計學意義( P ＜ 0. 05) ，地塞米松組無統計學差異( P ＞ 0. 05) 。在升高 fas 表達方面，平目湯高劑量組與平目湯中 劑量組、平目湯低劑量組比較，差異有統計學意義( P ＜ 0. 05) 。平目湯中劑量組與平目湯低劑量組比較，無統計學 差異( P ＞ 0. 05) 。

3 討論

Fas/fas L 通路，即死亡受體通路，死亡受體的活化 是誘導細胞凋亡的重要途徑之一。fas，相對分子量為 45 kDa，是腫瘤壞死因子/神經生長因子( TNF/NGF) 受體超家 族成員之一，由 325 個氨基酸組成的受體分子，為Ⅰ型跨膜 糖蛋白，胞內段帶有特殊的死亡結構域( DD) ，是一種調節 細胞凋亡的膜蛋白。fas L，分子量約為 40kDa，為Ⅱ型跨膜 糖蛋白，同屬于腫瘤壞死因子( TNF) 超家族，為 Fas 的天然配體，兩者結合可以啟動凋亡信號轉導，引起細胞死 亡。fas L 是同源三聚體，1 個 fas L 分子可以結合 3 個 fas 分子，三聚化的 fas 分子的 DD 相聚成簇，與帶有相同死 亡結構域的連接蛋白 FADD 的 DD( C 端) 結合，形成 fas － FADD 復合體，再由 FADD 的 N 端傳遞死亡信號，引發級聯 反應，致細胞凋亡。Graves 病的甲狀腺細胞存在凋亡 現象，研究人員在 Graves 患者甲狀腺組織、甲狀腺細 胞中發現 fas、fas L 呈高表達。Hara 等研究發現 GD 患者甲狀腺功能亢進時，sFas 表達水平升高，當甲狀腺 功能恢復正常時，sFas 的表達水平則降低。Koga M 等 選取甲狀腺相關性眼病患者的眼外肌組織，發現眼外肌纖 維及間質細胞均存在細胞凋亡，且凋亡程度與眼外肌的增 粗程度呈正相關，進一步發現眼外肌纖維中 fas 顯著表達。 通過文獻回顧，我們推測 fas/fas L 可能是一個有效防治 GO 的潛在性靶點。