利用TALEN技術構建豬內源性基因Tiki1打靶豬模型

體細胞核移植技術在農業家畜育種和人類 (Homo sapiens)疾病動物模型的建立等領域具有重 要的價值。小鼠（Mus musculus)器官大小和各項生 理指標均與人類相差較大，無法準確的模擬人類的 生長發育和疾病發生發展過程。非人靈長類動物 與人類無論是進化角度還是具體生理指標等在各 個方面都極為相似，但是其資源匱乏，飼養費用昂 貴，再加上倫理道德問題，極大限制了非人靈長類 在科學研究中的應用。選擇豬(Sus scrofa)作為轉基 因動物模型，能更有效地模擬人類的生長、發育和 疾 病 發 生 等 生 理 病 理 過 程 (Robert, 2005; Houdebine, 2009; Herreros-Villanueva et al., 2012)。

1 材料與方法

1.1 材料

分子實驗相關試劑無特殊說明均購自TaKaRa 公司（大連)，化學試劑無特殊說明均購自Sigma公 司（美國)，細胞培養相關試劑無特殊說明均為Gibco（美國)。實驗豬（Sus scrofa)來自中國科學院廣州 生物醫藥與健康研究院醫用豬大動物基地，所用細 胞由中國科學院廣州生物醫藥與健康研究院賴良 學實驗室分離凍存。所用豬卵從廣州市屠宰場取 回后由本實驗室體外培養成熟。

1.2 實驗方法

1.2.1 TALEN構建和體外活性檢測

1.2.1.1 TALEN設計及構建

根據 Tiki1 基因外顯子 4 設計 1 對 TALEN 質 粒，TALEN 質粒的組裝和活性檢測交由北京唯尚 立德生物公司完成。

1.2.1.2 TALEN體外活性檢測

體外檢測TALEN活性采用的是單鏈復性（single-strand annealing, SSA)方法，通過檢測熒光素酶 活性，預測TALEN的切割活性，重復3次。

1.2.2 TALEN質粒體外轉錄

按照試劑盒 mMESSAGE SP6（Ambion, 美國) 和大腸桿菌(Escherichia coli) Poly（A) Polymerase （NEB, 美國)的操作步驟進行。

1.2.3 孤雌激活胚的制備

將成熟卵母細胞放入融合液，進行平衡，將平 衡好的胚胎移入融合槽內，進行電脈沖刺激。胚胎 融合的同時激活。

1.2.4 TALEN mRNA胞質注射

用 顯 微 操 作 系 統 注 射 針 將 1~2 pL TALEN mRNA 注射進胚胎細胞質，并放入豬合子培養液 (porcine zygote medium-3, PZM-3)中置于培養箱（上海精宏試驗設備提供）。 胚胎培養7 d后統計囊胚率。

1.2.5 體外胚胎鑒定

根據豬Tiki1基因序列及設計的質粒的打靶序 列，用PCR方法進行擴增及測序鑒定。引物序列：F：5' -CTGCTGAGCTACCAGGGAAC-3'；R：5' -ATGTCCTGGAGGTTCTCACC - 3'。 PCR 反 應 體 系 (25 μL)：2×Premix Tag 12.5 μL，10 μmol/L 上、下游 引物分別為 0.5 μL，DNA 模板 1 μL，ddH2O 10.5 μL。反應條件為：95 ℃預變性 5 min；95 ℃變性30 s，59 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 30 s，共 35 個循環； 72 ℃ 7 min；4 ℃保存。

1.2.6 細胞轉染篩選及鑒定

1.2.6.1 轉染

取約 1×107 個細胞，轉入電轉杯中，加入 TALEN質粒與pcDNA 3.1質粒各50 μg，經電轉儀共轉 染 豬 胎 兒 成 纖 維 細 胞 (porcine fetal fibroblasts, PFFs）。

1.2.6.2 篩選

電轉后細胞分裝到15個10 cm培養皿中，隔天 換為含遺傳霉素(geneticin, G418)的細胞培養基，篩 選8~10 d后，挑取細胞克隆。

1.2.6.3 細胞克隆的PCR鑒定

細胞克隆采用 PCR 產物測序鑒定方法(同 1.2.5)。PCR產物送深圳華大基因測序。 

2 結果與分析

根據哈佛大學兒童醫學院賀熹教授團隊提供的人 Tiki1 基因的完整的 cDNA 序列(Zhang et al., 2012)，在豬的基因組數據庫里比對，發現預測的豬 Tiki1基因位于第3號染色體上，其預測的外顯子4 序列與人 Tiki1 基因的同源性最高，因此在預測的 豬 Tiki1 基因外顯子 4 設計 1 對 TALEN (TALEN-L 和TALEN-R)，具體序列。把體外轉錄的 TALEN mRNA 分別以 0、4、20 和100 ng/µL注射到豬的孤雌激活胚中，體外培養 到囊胚，檢測囊胚率和打靶效率。對照組注射等體 積的 H2O 內含 0 ng/µL TALEN mRNA，注射 135 個 豬孤雌激活胚后共計獲得囊胚 58 個，囊胚發育率 為42.9% (58/135)；當注射的TALEN mRNA為4 ng/ µL濃度時，注射160個豬孤雌激活胚后共計獲得囊 胚 44 個，囊胚發育率為 27.5% (44/160)；當注射的 TALEN mRNA 為 20 ng/µL 濃度時，注射 160 個豬 孤雌激活胚后共計獲得囊胚 47 個，囊胚發育率為 29.4% (47/160)；當注射的TALEN mRNA為100 ng/ µL濃度時，注射160個豬孤雌激活胚后共計獲得囊 胚32個，囊胚發育率為20.0% (32/160)(表1)。以上 結果說明，隨著TALEN mRNA注射的濃度的增大， 對豬孤雌胚的發育影響較小。

3 討論

Tiki1基因是哈佛大學兒童醫學院賀熹教授實驗室發現的一個對蛙頭部的誘導起到決定性作用 的新基因(Zhang et al., 2012)，近年來 Tiki1 基因作 為 Wnt 信號通路中新的抑制因子(Zhang et al., 2016a; Zhang, He, 2016)進入了人們的視野,但Tiki1 在小鼠等嚙齒類動物中缺失(Bazan JF et al., 2013)， 因而無法利用嚙齒類動物模型研究Tiki1基因在哺 乳動物發育過程中的作用。而且小鼠等嚙齒類實 驗動物模型在器官大小、解剖結構等各方面均與人 類有很大差異，現已建立的小鼠疾病模型大多只能 模擬人類疾病的部分癥狀，阻礙了對人類疾病的發 病機理和治療方法的研究(Vodicka et al., 2005)。