上海精宏淺談病原菌鑒定與抑菌實驗

錦帶花是城市園林中常見的綠化美化樹種，是大連園林主 栽樹種。研究表明，錦帶花可以凈化空氣，吸收粉塵、大氣污 染物，提高市區的空氣質量。錦帶花還具有極高觀賞價值， 枝葉茂密，花色艷麗，花期長，其對氯化氫抗性強，是良好的 抗污樹種，具有較高的美化和環保價值。同時，錦帶花還 具有一定的藥用價值，可用于治療瘟病初期、頭痛咽干、喉 痹、癰腫疔瘡、丹毒等癥。近些年來，大連市區錦帶花染 上了較為嚴重的葉斑病，輕者可使樹木提前落葉，嚴重可導致 整株死亡。因此，查明其發病病因，為其病害防治提供理論依 據已成為當務之急。

一、材料與方法

(一)實驗材料 錦帶花葉斑病葉片和健康葉片為實驗材料。

(二)研究方法

1.病害調查、癥狀觀察與采樣 在有錦帶花發病區的地段，我們隨機采取感病植株的感病 葉片50片，裝入塑料袋中備用(供分離純化病原菌用)。在自然條 件下，觀察病害癥狀特點，如有無明顯的病征，外部病變等。
2.病原菌的分離與純化 本實驗采用單斑分離法，在病健交界處剪取約4mm2 的 病組織數塊，經酒精消毒，放置培養基中，在28℃恒溫箱 培養3～4天，計算真菌分離率。我們挑取單個分生孢子， 進行單孢純化。
3.分離菌致病性檢測 依據科赫法則檢測。
4.病原菌鑒定
1)病原菌的形態學鑒定：我們用肉眼觀察菌落正、反面顏 色及是否有輪紋等；顯微鏡下觀察分生孢子形態，記錄產孢時 間。依據菌株形態特征，初步鑒定分離菌的種類。
2)病原菌的分子生物學鑒定：利用真菌通 用引物ITS1和ITS4。其引物序列：ITS1(5’- TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)和ITS4(5’- TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)。我們用MEGA5.0軟 件進行序列分析，鄰近法構建分子系統發育樹。
5.農藥抑菌試驗
1)農藥培養基配置：我們將農藥代森錳鋅、百菌靈和苯 醚甲環唑分別配成濃濃為80μg/L、150μg/L、220μg/L、 290μg/L、360μg/L的培養基做為實驗組；對照組加等量的 無菌水。
2)接種菌餅：我們將菌餅接種于混有藥劑和無菌水的PDA 平板中央進行編號，然后轉移至28℃恒溫培養箱(上海精宏DNP-9272電熱恒溫培養箱)中，培養4 天，測量菌落直徑，計算抑菌率。

二、結果與分析

主要發病部位為葉片，其他部位未見發病。葉片發病初 期，染病部位褪綠變黃，逐漸形成枯斑，無規律地分布在葉片 上，隨著病情加重，可導致穿孔最后葉片逐漸枯死。(圖1)

(二)單斑分離率 我們采用單斑分離法，從發病的錦帶花感病組織中分離出2 株真菌，分別命名為A2和B1。其單斑分離率各為67%、30%。其 中，菌株A2的分離率較高，我們初步認為是該葉斑病的致病菌。
(三)分離菌株的致病性檢測 將分離出的兩株真菌接種至健康葉片后，A2可使健康的 錦帶花葉片發病，發病率為100%；接種B1未見發病。對接種 發病葉片進行單斑分離鑒定，我們在顯微鏡下觀察可見，分離 菌與接種菌的菌落形態一致。由此可斷定：A2為錦帶花葉斑 病的致病菌(見圖2)。

三、討論

我國園林植物種類繁多，其植物病害的種類也十分復雜。園 林植物在自然生長過程中，極易受到各種病原微生物的侵染。其 中主要以真菌性病害為主，而葉斑病是影響植株美觀和品質較為 嚴重的病害。在錦帶花大面積種植的背景下，查明其葉斑病的 病原菌，找到一種經濟高效的抑制或治療錦帶花葉斑病的方法顯 得尤為重要。本實驗采用植物病理學研究法，對大連市錦帶花葉 斑病病原菌進行了形態學和分子生物學鑒定，結果顯示病原菌為 鏈格孢屬(Alternaria)的鏈格孢菌(Alternaria alternata)。



 

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