好氧反硝化菌種的復蘇培育剖析

藤黃球菌( Micrococcus luteus) 所分泌的復蘇促進因子( resuscitation-promoting factor，Rpf) 的發 現被認為是復蘇培養 VBNC 狀態菌最重要的突 破。Rpf 在皮摩爾濃度下即可使自身處于 VBNC 狀態的細胞復活，并使可培養數量增長至 100 倍 以上，且可促進細胞的生長。研究發現制藥廢 水中對 Rpf 敏感的 VBNC 優勢菌群主要有革蘭氏 陽 性 ( G+ ) 菌 如 Microbacterium、Gordonia 和 Leucobacter 屬 等，及 革 蘭 氏 陰 性 ( G－ ) 菌 如 Candidimonas、Xanthobacter 和 Aminobacter 屬 等。

高氨氮廢水取自浙江省金華市某工業污水處 理廠，其 COD 為 500 mg /L，NH+ 4-N 為 420 mg /L， NO－ 2-N 未檢出，NO－ 3-N 為 10 mg /L，pH 值為 7. 2。 1. 2 儀器 紫外分光光度計( UV-7504，上海欣茂儀器有限公司) ; 恒溫培養振蕩器( ZHWY-100C 上海智 誠儀 器 分 析 制 造 公 司) ; 臺 式 離 心 機 ( 5417R， Eppendorf) ; 恒溫恒濕培養箱( HWS-350，寧波海 曙塞富實驗儀器廠) ; 電子天平( JY3002，上海精密科學儀器有限公司 ) ; 移 液 槍 ( P500， Eppendorf) ; 電熱鼓風干燥箱( DHG-9070A，上海精宏實驗設備有限公司) 。

將 M． luteus 的 rpf 基因克隆在 Escherichia coli BL21 ( DE3) 中誘導表達，經純化后獲得 Rpf 蛋白。 具體步驟簡述如下: 將 質 粒 轉 化 的 Escherichia coli BL21( DE3) 接種至含有 50 mg /L 相應抗生素的 LB 液體培養基中，37 ℃，120 r/min 培養至對數生長期，然后再接種至 200 mL SOB 培 養基中擴大培養，確認轉化細菌濃度為 OD600 = 0. 6 時，加入 IPTG 誘導劑至終濃度為 1 mmol /L， 20 ℃，120 r/min 誘導過夜。 離心( 12 000 r/min，10 min) 收集細胞，加入 緩沖液重懸菌體，并超聲破碎使得蛋白釋放出來。 經 Ni 柱吸附，100 mmol /L 的咪銼洗脫液洗脫后， 再利用純化試劑盒對目的蛋白進行純化。提純的 Rpf 蛋白經 0. 22 μL 微孔濾膜過濾后，加甘油至終 濃度為 50%，置于－20 ℃ 保存備用。同時，將 Rpf 蛋白高壓滅活( 121 ℃，20 min) 用于對照組的實 驗研究。

VBNC 菌的復蘇促進作用 MPN 培養體系中，吸取 1 mL 采自于污水處 理廠的高氨氮廢水加入至 9 mL LB 液體培養基 中，而后依次稀釋，連續設置 10 個稀釋梯度，每一個梯度設立 3 個平行。在各處理組稀釋液均 添加 0. 25% Rpf 蛋 白，對照組各稀釋 液添加 0. 25%無活 性 Rpf 蛋 白 上 清 液，將 樣 品 放 置 在 30 ℃ ，120 r/min培養體系中生長。通過測定處理 組與對照組培養液菌體密度( OD600 ) 來反映 Rpf 對菌體生長狀況的影響。同時記錄樣品的濁度以 獲得 MPN 值，利用 MPN 表計算出每個樣品中可 培養細菌的總數。 當細菌總數處于穩定，將處理組與對照組培 養液最大稀釋度分別涂布于固體平板中獲得可培 養細菌。對比兩組涂布平板的菌落差異，僅存在 于處理組的菌株則為對 Rpf 蛋白敏感的 VBNC 菌。將純化后的的菌株擴大培養并收集至 10% 的甘油中，－80 ℃ 保存。每種稀釋度的剩余培養 液則放至－20 ℃保存備用。

基因經克隆，并在 Escherichia coli BL21 ( DE3) 中誘導表達及系列純化后，獲得 Rpf 重組蛋白。結果如圖 1 所示，由 SDS-PAGE 圖可 知，蛋白洗脫液中含有清晰的目的條帶，重組蛋白 的分子量約為 23 kDa，且雜條帶數量相較于粗體 液明顯減少，說明經 Ni 柱洗脫后得到了純度較高 的 Rpf 蛋白。 本研究中所獲的重組蛋白的分子量相對于 Mukamolova 等從藤黃球菌上清液中分離提取的 Rpf 蛋白( 16～17 kDa) 偏大，其原因為此重組蛋白 未去除 N 端的 6 個 His 標簽。同時，與 Mukamolova 等所獲的重組蛋白分子量( 25 kDa) 相當。每隔 24 h 記錄 MPN 培養體系中處理組和對 照組在 600 nm 處的光密度值。當數值趨于穩定 后，讀取 MPN 值。在培養體系中，處理組最后 3 個稀釋度分別有 3 個，3 個和 2 個渾濁管，對照組 分別有 3 個，3 個和 1 個渾濁管，透明管意味著其 OD600值接近于 0。在各稀釋度中，處理組的菌體 生長量均大于對照組，尤其是在最后的稀釋度中，這表明 Rpf 可促進細菌的生長。

1) 本研究表明高氨氮廢水中存在大量對 Rpf 敏感的 VBNC 細菌，其數量占總菌數的 58. 1%。 并分離純化 4 株 VBNC 菌株，其中 ZYR51 歸屬于 Gordonia 屬，菌 株 CHZYN52、CHZYR61 和 CHZYR63 均歸屬于 Pseudomonas 屬。

2) 本研究表明 Pseudomonas 和 Gordonia 屬可 能為高氨氮廢水中存在的主要 VBNC 功能菌群， 經 Rpf 復蘇后具有較好的好氧反硝化性能。

3) 本研究揭示在高氨氮廢水中，與藤黃球菌 具有較好親緣關系的 Gordonia 屬菌株 ZYR51 的 脫氮性能最強。從而為挖掘高效好氧反硝化菌提 供新的思路。