電熱恒溫培養箱的激動劑篩選體系建立

材料與儀器

Sigma 3K15 臺 式 高 速 低 溫 離 心 機（ 美 國 Sigma 公司）；恒溫搖床（上海精龍躍儀器設備有 限公司）；電熱恒溫培養箱（上海精宏實驗設備有限公司）；超聲波細胞粉碎機（寧波新芝生物 科技股份有限公司）；PowerPacTMBasic 電泳儀， T100TMThermal Cycler PCR 儀（美國伯樂公司）； Spectra M5 多功能連續光譜酶標儀（美國分子儀 器公司）；Tanon-4100 全自動凝膠成像分析系統（上 海天能科技有限公司）；Biacore T200 生物大分子 互作儀（美國通用公司）。GK-pCMV6-entry（Origene）、pET28a（本實 驗室 ?80 ℃保存）

實驗方法

將測序正確的融合蛋白質粒轉入大腸桿菌表 達菌株 BL21（DE3），平板涂布于含 0.1 mol·L?1 卡那霉素的固體 LB 培養板上，于 37 ℃培養箱中 倒置培養過夜。次日挑取單菌落搖菌至渾濁，后 按 1 ∶ 100 的比例轉接進新的 LB 液體培養基并于 37 ℃振搖培養箱中振搖培養（150~170 r·min?1）， 菌液 OD600 至 0.6 左右分別加入不同濃度 IPTG， 孵育不同時間，低溫收集菌體并超聲破碎取上清， 利用 SDS-PAGE 蛋白電泳分析不同誘導條件下蛋 白的表達情況以確定最佳誘導表達條件。首先是蛋白的預富集， 將蛋白用 pH 4.5、5.0、5.5 的醋酸鈉分別稀釋到 10 μg·mL?1，通過預富集實驗確定 pH 5.0 為最佳 偶聯條件。芯片用 0.4 mol·L?1 EDC 和 0.1 mol·L?1 NHS 按體積比 1 ∶ 1 混 合 活 化， 用 pH 5.0 的 醋酸鈉將蛋白稀釋至 10 μg·mL?1 進 行 偶 聯， 以 1 mol·L?1 乙醇胺（pH 8.5）封閉活化的芯片表面。 受試化合物用 PBST 緩沖液稀釋到 50、25、12.5、 6.25、3.125、1.562 5 μmol·L?1 后放入儀器。實驗 結果用自帶數據分析軟件 Biacore T200 Evaluation Software 分析。

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