豬卵泡顆粒細胞表型分析！！！

    探討干擾和過表達ＢＡＭＢＩ基 因對豬卵泡顆粒細胞的表型和功能的影響以及其對 ＴＧＦ－β通路下游相關基因及凋亡基因的表達調控， 為解析豬卵泡發育和排卵數量調控機理提供依據。大腸桿菌ＤＨ５α感受態細胞、無毒素質粒小提／ 大提試劑盒、普通瓊脂糖凝膠 ＤＮＡ 回收試劑盒、酵 母提取物、胰蛋白胨均購自天根生化科技（北京）有 限公司；限制性內切酶 ＮｏｔⅠ、ＢａｍＨⅠ和 ＥｃｏＲⅠ、 Ｔ４ＤＮＡ 連接酶和 ＲＮＡ 逆轉錄試劑盒均購自寶生 物工程（大連）有 限 公 司；總 ＲＮＡ 提取試劑盒購自 上海普洛麥格生物制品有限公司；氨芐青霉素購自 哈爾 濱 制 藥 六 廠；Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００ 和 ＤＭＥＭ／ Ｆ１２均購 自 英 杰 生 命 技 術 有 限 公 司；青 霉 素 購 自 Ａｍｒｅｓｃｏ公司；ＡｎｎｅｘｉｎＶ－ＦＩＴＣ／ＰＩ細胞凋亡檢測 試劑盒購自 ＣＳＴ 公司。 超凈工作臺購自上海博迅醫療設備廠；超低溫 冰箱（－８０ ℃）和臺式 高 速 離 心 機 均 購 自 賽 默 飛 世 爾 科 技 公 司；ＣｙｃｌｅｒＴＭ ＴｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅｒＰＣＲ 儀、儀均購自Ｂｉｏ－Ｒａｄ公司；ＤＮＰ－９０５２型電熱恒溫培養 箱和 ＤＫＢ－５－１Ａ 型超恒溫水浴鍋均購自上海精宏實 驗設備有限公司；ＤＨＧ－９２４０ＡＳ型電熱恒溫鼓風干 燥箱購自寧波東南儀器有限公司；ＭＯ－２２７０ＭＩ（Ｎ） 微波爐購自青島海爾制品有限公司。

    利用實時熒光定量 ＰＣＲ 方法 檢 測 卵 泡 顆 粒 細 胞過表達和 干 擾 ＢＡＭＢＩ后，ＴＧＦ－β信 號 通 路 中 下 游基 因（ＴＧＦ－βＲⅠ、ＴＧＦ－βＲⅡ、ＳＭＡＤ１、ＳＭＡＤ２、 ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＤ５）和 細 胞 凋 亡 基 因（Ｂａｘ、 Ｂｃｌ－２）ｍＲＮＡ 的 表 達 水 平，以 ＧＡＰＤＨ 為 內 參 基 因。根據 ＮＣＢＩ公布的豬基因編碼區，利用 Ｐｒｉｍｅｒ Ｐｒｅｍｉｅｒ５．０設計實時熒光定量 ＰＣＲ 引物，送生工 生物工程（上海）股份有限公司合成，ＰＣＲ 反 應 體 系 ２５μＬ：ｃＤＮＡ 模 板 １μＬ， ＳＹＢ Ｇｒｅｅｎ Ｍｉｘ 染 料 １２．５ μＬ，上、下 游 引 物 （１０μｍｏｌ／Ｌ）各１μＬ，ｄｄＨ２Ｏ９．５μＬ。實時熒光定 量 ＰＣＲ 反 應 程 序：９５ ℃ 預 變 性 ５ ｍｉｎ；９５ ℃ 變 性 １０ｓ，退火（具體溫度見表２）２０ｓ，７２℃延伸１０ｓ，共 ４５個循環；７２℃延伸４ｍｉｎ；４℃保存。試驗對所有 樣本均進行３個重復測定，并在每次試驗時用同體 積的無菌水作為陰性對照。