微生物限度檢查方法驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

保婦康栓是由莪術(shù)油、冰片等制成的中藥栓劑，主治行 氣破瘀、生肌止痛，用于治療濕熱瘀滯所致的帶下病、霉 菌 性陰道炎、宮 頸 糜 爛 等。由于莪術(shù)油有一定的抑菌性， 不能按照常規(guī)法進(jìn)行微生物計數(shù)，需要建立新的微生物限 度計數(shù)方法，充分消除莪術(shù)油的抑菌作用，使得其作用可以 忽略不計。這樣使得檢測結(jié)果可以真實(shí)反映此中藥栓劑的 實(shí)際污染情況。本研究主要對保婦康栓的微生物限度計 數(shù)方法和控制菌檢測方法進(jìn)行驗(yàn)證，以找到簡便易行的保 婦康栓微生物檢查方法。現(xiàn)將實(shí)驗(yàn)過程總結(jié)報道如下。

３ 批 保 婦 康 栓，批 號 分 別 為：２０１５０５０２，２０１５０４０７， ２０１５０９０９。生產(chǎn) 廠 家：海南碧凱藥業(yè)有限公司。規(guī) 格 為： １．７４ｇ／粒，１４粒／盒。

銅綠假 單 孢 菌 ［ＣＭＣＣ（Ｂ）１０１０４］、金黃色葡萄球菌 ［ＣＭＣＣ（Ｂ）２６００３］、枯草芽孢桿菌［ＣＭＣＣ（Ｂ）６３５０１］、黑曲 霉［ＣＭＣＣ（Ｆ）９８００３］、白色念珠菌［ＣＭＣＣ（Ｆ）９８００１］（以上 菌種均由浙江省食品藥品檢驗(yàn)研究院提供）。

胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（批號１７１００９）、胰酪大 豆 胨 瓊 脂培養(yǎng)基（批 號 １７１１２５４）、沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基 （批 號 １６１０１６２）、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（批號１６１２２５）、溴化十六 烷基三甲銨培養(yǎng)基（批號１６０６１８２）、甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng) 基（批號１７０６３０）、梭菌增菌培養(yǎng)基（１６０９０６）、哥倫比亞瓊脂 培養(yǎng)基（批號２０１６０７２１）、念珠菌顯色培養(yǎng)基（１６０１０４）。除 了哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基由青島高科園海博生物技術(shù)有限公 司生產(chǎn)外，其余均由北京三藥科技開發(fā)公司生產(chǎn)。以 上 培養(yǎng)基均按照２０１５版《中華人民共和國藥典》一部附錄配制， １２１℃高壓滅菌２０ｍｉｎ，４５℃恒溫備用。

ＭＪＰ－１５０霉菌培養(yǎng) 箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）、 ＳＨＰ－０８０生化培養(yǎng)箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）、ＢＳＣ－ １０００ＩＩＢ２生物安 全 柜（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）、ＹＪ－ ８７５Ｓ／ＤＢ凈化 工 作 臺 （吳江市雄峰空調(diào)凈化設(shè)備有限公 司）、ＤＫ－６００電熱恒溫水槽（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）、 ＭＪ－５４Ａ 高壓 滅 菌 器 （上海施都凱儀器設(shè)備有限公司）、 １０１Ａ－３電熱恒溫干燥箱 （杭州卓馳儀器有限 公 司 ）、 ＴＤ２００１Ｂ電子天平（余姚市金諾天平儀器有限公司）。

①分別取接種有金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草 芽孢桿菌培養(yǎng)物的胰酪大豆胨瓊脂斜面的試管各一支，加３ ～５ｍＬ０．９％ 無菌氯化鈉溶液沖洗斜面，吸 出 菌 液，取 出 １ｍＬ菌液加０．９％無菌氯化鈉溶液９ｍＬ，采用１０倍遞增稀 釋法，稀 釋 至 １０－５ ～１０－７，使得菌落數(shù)約為 １０～１００ｃｆｕ· ｍＬ－１；

②分別取接種有白色念珠菌、黑曲霉培養(yǎng)物的沙氏葡 萄糖瓊脂斜面的試管各一支，加３～５ｍＬ０．９％無菌氯化鈉 溶液沖洗斜面，吸出菌液，取出１ｍＬ菌液加０．９％無菌氯化 鈉溶液９ｍＬ，采用１０倍遞增稀釋法，稀釋至１０－４ ～１０－６，使得 菌落數(shù)約為１０～１００ｃｆｕ·ｍＬ－１。

２．２ 供試液制備
 

取本品１０ｇ，加胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基至４００ｍＬ，再加 入１％的吐溫８０（經(jīng)過高溫滅菌），振蕩器振搖至供試品分散 均勻，制成１∶４０的供試液。

（１）需氧菌計數(shù)方法 驗(yàn)證：供試品稀釋→平皿法：

    ①菌液組：采用平皿計數(shù)法，分 別取各菌液１ｍＬ，每個菌株平行注入２個平皿。測定上述 制備好的菌液中的菌落數(shù)；

    ②供試品組：分 別?。薄茫矗肮┰囈海保恚套⑷耄矀€平皿，分別測定供試品的 需氧菌數(shù)，結(jié)果 見 表 ３；

    ③ 試 驗(yàn) 組：按照供試品組的方法操 作，再分別取上述菌液１ｍＬ（約３０～１００ｃｆｕ·ｍＬ－１），分別注 入各個平皿中，測定結(jié)果見表４。以上３組已注入供試液的 平皿（其中試驗(yàn)組在注入供試液和菌液后應(yīng)立即傾注培養(yǎng) 基），需氧菌計數(shù)，傾注胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，待 凝 固 后， ３４℃培養(yǎng)３天逐日觀察結(jié)果。霉菌和 酵 母 菌 計 數(shù)，傾 注 沙 氏葡萄糖瓊脂 培 養(yǎng) 基，待 凝 固 后，２４℃ 培 養(yǎng) ５天 逐 日 觀 察 結(jié)果。

    ①菌液組：采用與上述 “需氧菌計數(shù)方法驗(yàn)證”相同的操作；

    ②供試品組：分別?。?∶４０供試液１ｍＬ 注 入 平 皿，測定供試品的霉菌和酵母菌 數(shù)；

    ③試驗(yàn)組：同上述“需氧菌計數(shù)方法驗(yàn)證”相同操作。

（３）稀釋劑組的方法驗(yàn)證。供試品換成胰酪大豆胨液 體（已 加 高 溫 滅 菌 １％ 的 吐 溫 ８０），方 法 同 供 試 品。

因?yàn)楸D康栓產(chǎn)品說明書中含莪術(shù)油，主 要 治 療 霉 菌 性陰道炎、老年性 陰 道 炎、宮 頸 糜 爛 等，說明此栓劑有一定 的抑菌作用，供試品溶液（１∶１０）采用平皿法計數(shù)，意 義 不 大。于是對前期供試品溶液（１∶２０）采用平皿法計數(shù)，無法 通過適用性檢查，回收率如表１所示。

　從表１中看出，金黃色葡萄球菌和白色念珠菌回收率＜５０％，表明此栓劑對金黃色葡萄球菌和白色念珠菌有抑 制作用?！”D康栓的菌檢計數(shù)方法如果采用供試液稀釋法，方 法如下：取１∶４０的供試液１ｍＬ注入平皿，測定需氧菌數(shù)； 取１∶４０的供試液１ｍＬ注入平皿，測定霉菌和酵母菌數(shù)。

本研究采用供試品稀釋→平皿法對保婦康栓微生物限 度計數(shù)方法進(jìn)行驗(yàn)證，如果采用培養(yǎng)基稀釋法把１ｍＬ供試 液（１∶１０）吸取到０．５ｍＬ／平皿、０．２ｍＬ／平皿時，使用的玻 璃平皿數(shù)量較多，且操作繁瑣易污染，直接把原樣品直接稀 釋到１∶２０或者１∶４０進(jìn)行日常的微生物限度檢查，這樣平 皿數(shù)量可以大為減少。 由于保婦康栓組成中有莪術(shù)油，它具有一定的抗炎抑 菌作用，所以進(jìn)行微生物限度檢查時必須對計數(shù)方法進(jìn)行 比較、驗(yàn)證，確保方法安全穩(wěn)定，結(jié)果可靠。 薄膜過濾法由于預(yù)實(shí)驗(yàn)中栓劑無法順利通過薄膜，過 濾膜后的培養(yǎng)結(jié)果不理想，所以沒有進(jìn)行方法比 較。２０１５ 版藥典中微生物計數(shù)法的計數(shù)方法新增了 ＭＰＮ 法，用于微 生物計數(shù)時 ＭＰＮ 法的精確度比較差。ＭＰＮ 法的準(zhǔn)確 度 和精密度不及平皿計數(shù)法，而且霉菌計數(shù)也不能使用此方 法，僅在沒有適宜計數(shù)方法對供試品需氧菌總數(shù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn) 的情況下方能使用。因此，本研究未對 ＭＰＮ 法進(jìn)行研究。