GLP-1分泌的相關性研究(精宏水浴鍋使用)

２型糖尿病（Ｔｙｐｅ２ｄｉａｂｅｔｅｓｍｅｌｌｉｔｕｓ，Ｔ２ＤＭ） 是遺傳和環境等多種因素聯合作用而導致的胰島素 抵抗（Ｉｎｓｕｌｉｎｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ，ＩＲ）與胰島素相對分泌不 足，致使葡萄糖、氨基酸及脂質代謝綜合紊亂的一種 全身慢性代謝性疾病。據２０１７年ＪＡＭＡ 發表的研 究文章顯示，中國糖尿病患病率為１０．９％，糖尿病 前期約為 ３５．７％。糖尿病患者全球 已 逾１．７億，其 中２型糖尿病占９０％左右，目前發病率呈逐年上升 趨勢，已經成為繼心血管疾病和腫瘤之后的第三位主要非傳染性疾病。

１ 材料

１．１ 動物

ｃ５７ＢＬ／ＫｓＪｄｂ／ｄｂ２型糖尿病模型小鼠 ６只，６周齡雄 雌 各 半，其 對 照ｃ５７ＢＬ／ＫｓＪｄｂ／ｍ 小鼠６只，６周齡雄雌各半（購自江蘇南京鵬晟生物科技發展有限公司），飼養于新疆醫科大學 ＳＰＦ 級 動 物實驗中心。

１．２ 主要試劑

ＱＩＡａｍｐＤＮＡＳｔｏｏｌＭｉｎｉＫｉｔ試 劑盒（德國 Ｑｉａｇｅｎ公司），ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＰＣＲｋｉｔ（德 國 Ｑｉａｇｅｎ公司），５０ｂｐＭａｒｋｅｒ（北京博邁德科技發展有限公司），溴乙靛（天根生化科技），瓊脂糖凝膠 ＤＮＡ 回收試劑盒（北京百泰克生物技術有限公司）， 胰高血糖素樣 肽１（ＧＬＰ－１）、Ｃ 肽（Ｃ－ｐｅｐｔｉｄｅ）酶 聯 免疫測定試劑盒（上海研輝生物有限公司）。

１．３ 主 要 儀 器

血 糖 儀 （羅 氏 ），凝 膠 成 像 儀 （ＡＩｐｈａＩｍａｇｅｒＨＰ），電 泳 儀、全 自 動 酶 標 儀、ＰＣＲ 擴增儀、實時熒光定量儀（美國 Ｂｉｏ－Ｒａｄ公司），低速 大容量多管離心機（上海安亭科學儀器廠），電熱恒 溫水浴鍋（上海精宏實驗設備有限公司），電子分析天平（北京賽多利斯天平有限公司），組織勻漿儀（寧波新芝生物科技股份有限公司），厭 氧 罐 及 厭 氧 袋 （日本三菱）。

２ 方法

２．１ 樣本采集及處理

２．１．１ 動物分組及糞樣的收集

６周齡ｄｂ／ｄｂ２型 糖尿病模型小鼠和對照組ｄｂ／ｍ 小鼠適應性飼養１ 周后，開始監測小 鼠（７－１２周）的 體 質 量 和 空 腹 血 糖（ＦＢＧ），收集每天下午４∶００－５∶００的新鮮糞樣 于凍存管中密封，迅速液氮冷凍后放入厭氧袋中，轉 存至－８０℃冰箱保存備用。

２．１．２ 血樣

實驗終末期用乙醚將小鼠麻醉后剖開腹部，收集門脈血及腹 主 靜 脈 血，３０００ｒ／ｍｉｎ離 心１５ｍｉｎ后分離血清，迅速放入液氮冷凍后，轉存 至－８０℃冰箱保存備用。 ２．１．３ 組織 小鼠處死后，收集結腸部位的內容物 及結腸組織，迅速液氮冷凍后，轉存至－８０℃冰箱保 存備用。

２．２ 腸道多形擬桿菌、史氏產甲烷短桿菌的檢測

２．２．１ 結 腸 內 容 物 和 糞 樣 腸 道 微 生 物 總 ＤＮＡ 提 取

按照 ＱＩＡａｍｐＤＮＡＳｔｏｏｌＭｉｎｉＫｉｔ試劑盒（德 國 Ｑｉａｇｅｎ公司）的使用說明提取結腸內容物和糞樣 中的細菌總 ＤＮＡ。

２．２．２ 總 ＤＮＡ 濃度測定及純度鑒定

以 ＴＥ 對照 液，取２μＬＤＮＡ 樣品，ＤａｎｏＤｒｏｐ１０００測定總 ＤＮＡ 在２６０ｎｍ 和 ２８０ｎｍ 處 的 吸 光 度。 取 ５μＬ 總 ＤＮＡ 和２μＬｌｏａｄｉｎｇｂｕｆｆｅｒ電泳經１％瓊脂糖凝膠電泳，８０Ｖ 電 壓４０ ｍｉｎ，凝 膠 成 像 儀 照 像，檢 測 總 ＤＮＡ 的純度與完整性。

２．２．３ 多形擬 桿 菌、史 氏 產 甲 烷 短 桿 菌

１６ＳｒＲＮＡ Ｖ６區 ＰＣＲ擴增 在１６ＳｒＲＮＡ Ｖ６可變序列區進 行細菌特異性引物的設計，用于引導１６ＳｒＲＮＡ Ｖ６ 可變區的 ＰＣＲ擴增反應，序列見表１。

２．２．３．１ 普 通 ＰＣＲ 體系和反應程序

反 應 體 系 （２０μＬ）：２×ＰＣＲ ｍｉｘ１０μＬ，上、下游引物（表１）各 ０．５ μＬ，細 菌 總 ＤＮＡ ２ μＬ，Ｎｕｃｌｅａｓｅ－Ｆｒｅｅ－ｗａｔｅ ７μＬ。反應 程 序：預 變 性 ９５℃、３ ｍｉｎ；變 性 ９５℃、 ３０ｓ，退火（表１）、３０ｓ，延伸７２℃、１ｍｉｎ，共３９個循 環；終延伸７２℃、５ｍｉｎ，４℃保持。

２．２．３．２ ＰＣＲ產物鑒定

ＰＣＲ產物經２．５％瓊脂糖 凝膠電泳，８０ Ｖ 電 壓 ４０ ｍｉｎ，凝膠成像儀下觀察 結果。

２．２．３．３ 多形擬桿菌、史氏產甲烷短桿菌

ＲＴ－ｑＰＣＲ 檢測

２．２．３．３．１ 標準曲線的建立

將多形擬桿菌、史氏 產甲烷 短 桿 菌 的 ＰＣＲ 產 物 經 切 膠、回 收 后 作 為 ＤＮＡ 標準品，將 標 準 品 稀 釋 為 濃 度 梯 度 為 １０１ ～ １０８ ｃｏｐｉｅｓ／μＬ的 ＤＮＡ 樣本作為陽性模板，同 時 以 Ｎｕｃｌｅａｓｅ－Ｆｒｅｅ－ｗａｔｅｒ為陰性 對 照，每 個 樣 平 行 重 復 ３次，反應體系（２０μＬ）：上、下游引物各０．５μＬ，熒 光染料（ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩ）１０μＬ，ＤＮＡ 模板２μＬ，Ｎｕ－ ｃｌｅａｓｅ－Ｆｒｅｅ－ｗａｔｅｒ７μＬ，反 應 程 序：預 變 性 ９５℃、 ２ｍｉｎ，變性９５℃、５ｓ，退火（表１）、３０ｓ，３５個循環。 由實時熒光定量 ＰＣＲ儀自動繪制擴增曲線、熔鏈曲 線，產 物 通 過 熔 鏈 曲 線 證 實。反 應 結 束 后 用 ＰＣＲ 儀附帶軟件分析，自動生成標準曲線。

２．２．３．３．２ 小鼠糞樣及結腸內容物多形擬桿菌、史 氏產甲烷短桿菌的檢測

按上述“２．２．３．３．１”中的反 應體系和程序進行實時熒光定量 ＰＣＲ反應，檢測小 鼠糞樣及結腸內容物中的多形擬桿菌、史氏產甲烷 短桿菌。 ２．３ ＧＬＰ－１的檢測 酶聯免疫法（ＥＬＩＳＡ）檢 測 門 脈血、結腸勻 漿 液 中 ＧＬＰ－１的 含 量：按 照 試 劑 盒 的 使用說明進行操作。

２．４ 檢 測 空 腹 Ｃ 肽 水 平

計算胰島素抵抗指數 （ＨＯＭＡ－ＩＲ）、分 泌 指 數（ＨＯＭＡ－ＩＳ） 空 腹 Ｃ 肽 采 用 ＥＬＩＳＡ 法檢 測，按照試劑盒的使用說明進行操 作。用空腹 Ｃ肽代替胰島素采用改良 ＨＯＭＡ（ＣＰ） 公式評價胰島素抵抗和胰島素的分泌指數。

３ 結果

結腸內容物中史氏產甲烷短桿菌 ＲＴ－ＰＣＲ 結 果顯示：與對照ｄｂ／ｍ 組小鼠相比，ｄｂ／ｄｂ組小鼠結 腸內容物史氏產甲烷短桿菌數量增加，差異有統計 學意義 （Ｐ ＜０．０５）。Ｐｅａｒｓｏｎ相 關 性 分 析 顯 示，腸 道 史 氏產甲烷短桿菌的數量與小鼠體質量 （ｒ＝０．５９，Ｐ ＜０．０１）、空腹血 糖（ｒ＝０．５０，Ｐ ＜０．０１）呈 正 性 相 關，見圖１１；與小鼠空腹Ｃ肽水平 （ｒ＝－０．４４，Ｐ ＜０．０１）、胰島分泌指數（ｒ＝－０．３９，Ｐ ＜０．０１）呈負性 相關，與胰島素抵抗指數（ｒ＝０．４９，Ｐ ＜０．０１）呈正 性相關。

４ 討論

近期越來越多的研究表明腸道微生態與２型糖 尿病的發 生、發 展 密 切 相 關。Ｎａｄｊａ等通 過 與 正 常青年人群相比，２型糖尿病青年人群腸道中的 多 形擬桿菌門／厚壁菌門比例較高，多形擬桿菌與血糖 呈正相關。Ｏｌｌｉ等的研究證實大量的腸道擬桿 菌可以影響實驗大鼠體質量。這種作用可能是通過 改變腸道微生物群的組成或通過微生物代謝物介導的。



 

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