恒溫培養(yǎng)箱使用于火龍果軟腐病病原菌的鑒定

火龍果 又名紅龍果、情人果和 仙蜜果等，因外表肉質(zhì)鱗片似龍鱗而得名，原產(chǎn)于墨 西哥南部及中美洲諸國的太平洋沿岸地區(qū)，現(xiàn)在我國 海南、福建、廣東、廣西、貴州和云南等省（自治區(qū)）均 有種植。大部分火龍果屬于仙人掌科，量天尺屬，其他則屬于蛇鞭柱屬。火龍果主要有三種 商業(yè)種類：紅皮白肉火龍果、紅皮 紅肉火龍果和紅皮深紅肉火龍果。火龍果集水果、蔬菜、花卉于一體，營 養(yǎng)豐富，深受消費(fèi)者青睞，具有廣闊的發(fā)展前景。

感病的紅皮深 紅 肉 火 龍 果 于２０１７年４月 采 自 海南省昌江縣某火龍果種植基地。

按常規(guī)方法對田間發(fā)病典型部位出現(xiàn)的癥狀進(jìn) 行描述，并拍攝病害的癥狀。

采用常規(guī)組織分離法對病原菌進(jìn)行分離，采 用瓊脂平板稀釋純化法進(jìn)行純化，并將純化菌株 轉(zhuǎn)入試管斜面于４℃保存。

將保存的菌株于 ＰＤＡ 培養(yǎng)基上２５℃培養(yǎng)２ｄ。 采用刺傷接種法，在每個果實(shí)上刺傷４個點(diǎn)，在刺傷 點(diǎn)上接種菌絲塊，以接種無菌 ＰＤＡ 培 養(yǎng) 基 為 對 照， 試驗(yàn)重復(fù)３次，用滅菌脫脂棉蘸取無菌水進(jìn)行保濕， ２４ｈ后移去脫脂棉，在常溫２５℃下，觀察發(fā)病情況。 若接種果實(shí)發(fā)病則取發(fā)病部位再分離，完 成 柯 赫 氏 法則驗(yàn)證。

將病原菌接種于 ＰＤＡ 培養(yǎng)基上，２５℃全光照下 培養(yǎng)２～３ｄ，觀察、記錄菌株的菌落形狀和顏色、病原 菌孢子的形狀，測量孢子大小，并拍照。

ＤＮＡ 的提取及分子生物學(xué)鑒定 將供試病原菌接種于 ＰＤＡ 上，２５℃全光照下培 養(yǎng)２～３ｄ，用無菌藥匙刮取菌絲體置于１．５ｍＬ無菌 離心管中，按照ＦｕｎｇａｌＤＮＡＫｉｔ真菌基因組 ＤＮＡ 快 速抽提試劑盒（ＯＭＥＧＡＢＩＯ－ＴＥＫ）說明，提取基因組ＤＮＡ。ＰＣＲ擴(kuò)增試劑盒２×ＥｓＴａｑ ＭａｓｔｅｒＭｉｘ、擴(kuò)增 引物購自生工生物工程股份有限公司。 分別采 用 引 物ＩＴＳ１（５′－ＴＣＣＧＴＡＧＧＴＧＡＡＣ－ ＣＴＧＣＧＧ－３′）／ＩＴＳ４（５′－ＴＣＣＴＣＣＧＣＴＴＡＴＴＧＡＴ－ ＡＴＧＣ－３′）和 ＬＲＯＲ（５′－ＡＣＣＣＧＣＴＧＡＡＣＴＴＡＡ－ ＧＣ－３′）／ＬＲ７（５′－ＴＡＣＴＡＣＣＡＣＣＡＡＧＡＴＣＴ－３′）對 序列進(jìn)行擴(kuò)增。ＰＣＲ 反應(yīng)體系（５０μＬ）：ＤＮＡ 模板 ２μＬ，上下游引物各２μＬ（１０μｍｏｌ／Ｌ），２×ＥｓＴａｑ ＭａｓｔｅｒＭｉｘ２５μＬ，ｄｄＨ２Ｏ１９μＬ。ＩＴＳ擴(kuò) 增 程 序： ９４℃預(yù)變性５ｍｉｎ；９４℃變性３０ｓ，５５℃ 退 火４５ｓ， ７２℃延伸１ｍｉｎ，共３０個循環(huán)；最后７２℃延伸１０ｍｉｎ。 ＬＳＵ 擴(kuò)增程序?yàn)椋梗础骖A(yù)變性５ｍｉｎ；９４℃變性３０ｓ， ５１℃退火４０ｓ，７２℃延伸１．５ｍｉｎ，共３０個循環(huán)；最 后７２℃延伸７ｍｉｎ，４℃保存。 用１％瓊脂 糖 凝 膠 電 泳 對 擴(kuò) 增 產(chǎn) 物 進(jìn) 行 檢 測。 ＰＣＲ產(chǎn)物委托 華 大 基 因（深 圳）股 份 有 限 公 司 純 化 和測序。測序 結(jié) 果 在 ＧｅｎＢａｎｋ 中 進(jìn) 行 ＢＬＡＳＴ，并 下載相關(guān)序列，用 ＭＥＧＡ６．０軟件采用鄰接法構(gòu)建 系統(tǒng)發(fā)育樹。

將直徑為５．０ｍｍ 的菌餅接于 ＰＤＡ 培 養(yǎng) 基 平 板中 央，分 別 置 于 １５、２０、２５、２８、３０、３２、３５、３７ 和 ４０℃共９個不同溫度的培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)。每處理 重復(fù)３次。４８ｈ后用十字交叉法測量菌落直徑。

ＰＤＡ 培養(yǎng)基滅菌以后，無 菌 條 件 下 用１ｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨ 和 １ ｍｏｌ／Ｌ ＨＣｌ溶 液 調(diào) 節(jié) ＰＤＡ 培 養(yǎng) 基 的 ｐＨ，將直徑為５．０ｍｍ 的菌餅分別置于ｐＨ 為３．０、 ４．０、５．０、６．０、７．０、８．０、９．０、１０．０和１１．０的 ＰＤＡ 培養(yǎng)基平板上，于３２℃恒溫培養(yǎng)箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）中培養(yǎng)。每處理 重復(fù)３次。４８ｈ后用十字交叉法測量菌落直徑。

將直徑為５．０ｍｍ 的菌餅接于 ＰＤＡ 培 養(yǎng) 基 平 板中央，分別置于連續(xù)光照、Ｌ∥Ｄ＝１２ｈ∥１２ｈ、連 續(xù)黑暗的 ３２℃ 恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每 處 理 重 復(fù) ３ 次。４８ｈ后用十字交叉法測量菌落直徑。

病害主要危 害 花 瓣、鱗 片 和 果 實(shí)。田 間 發(fā) 病 花 瓣首先凋萎，初期產(chǎn)生水漬狀淡褐色病斑，病斑迅速擴(kuò)展，造成整個花冠呈軟腐狀。

對健康的紅皮 深 紅 肉 火 龍 果 果 實(shí) 進(jìn) 行 接 種，以 無菌的 ＰＤＡ 為對照，５ｄ后針刺傷接種的果實(shí)全部 發(fā)病，接種產(chǎn)生的癥狀與田間發(fā)病的癥狀相同（圖 １ｇ～ｈ），而對照果實(shí)不發(fā)病（圖１ｉ）。對發(fā)病組織進(jìn) 行再分離，可得到與原分離株相同的病原菌，符合柯 赫氏法則，證明接種菌為火龍果軟腐病的致病菌。

３ 結(jié)論與討論

通過病害田間癥狀觀察、致病性測定、病原菌形 態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)鑒定，將引起海南紅皮深紅肉火 龍果軟腐病病原確定為桃吉爾霉Ｇ．ｐｅｒｓｉｃａｒｉａ。火龍 果的腐爛病害大部分由鐮孢屬引起，對桃吉爾霉引 起的腐爛病害報道較少，有云南郭力維等報道的火 龍果果腐病，廣西林珊宇等報道的火龍果軟腐病， 而目前海南對桃吉爾霉屬引起的軟腐病并未見報道。 該病菌在國外報道還可侵染海南蒲桃、桃、茄 子、番木瓜和番茄等，甚至可侵染蝦。 本研究由桃吉爾霉引起的紅皮深紅肉火龍果軟 腐病與已經(jīng)報道的匍枝根霉Ｒｈｉｚｏｐｕｓｓｔｏｌｏｎｉｆｅｒ 引 起的軟腐病在癥狀上難以區(qū)別，但是病原菌形態(tài) 明顯不同于匍枝根霉，匍枝根霉能產(chǎn)生假根和匍匐 菌絲，孢囊梗不分枝和不彎曲，而桃吉爾霉不能產(chǎn)生 假根和匍匐菌絲，孢囊梗多數(shù)１～２個 分 枝，個 別 孢 囊梗頂端彎曲。